结核分枝杆菌临床检验与进展

作者：深圳市第三人民医院（南方科技大学第二附属医院）/国家感染性疾病临床医学研究中心 马爱静 杨梁梓 傅佳鹏 刘志超 钱莘 李国保

据世界卫生组织（WHO）估计，2019年全球估计有1000万人感染结核病（Tuberculosis, TB），约有120万人死于结核病[1]。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核患者数量居世界第二位[1]。

近年来，随着现代结核病控制策略的广泛实施，我国结核病控制工作取得巨大成绩。然而，由于耐药结核病的存在以及我国人口密度密集，许多结核分枝杆菌感染者并没有获得足够的初步诊断，日益成为我国乃至全球结核病控制的一大难题。

为解决这个问题，国内外不断研究新的诊断检验方法，以期快速准确地诊断结核病。本文对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）快速诊断相关的当前技术以及潜在的新兴技术进行阐述，并对诊断新技术的发展及应用前景进行展望。

一、传统检测技术

抗酸杆菌（AFB）痰涂片染色镜检（SSM）是世界范围内结核病检查中使用最广泛的技术，并被WHO推荐在发展中国家的结核病控制中使用，是全程督导化学治疗（DOTS）策略的基础。SSM成本低廉，且对生物安全的要求最低。尽管不能区分死菌和活菌，不能确定药物敏感性，不能区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌，且检测敏感度不高［特别是对于人类免疫缺陷病毒（HIV）携带者和儿童而言］，在一些资源缺乏的国家，例如南非，痰涂片镜检已替换Xpert MTB/ RIF作为肺结核初始诊断测试[2]。

此外，近几年来，以实验室为基础的结核诊断也取得了显著的进步。荧光二极管（LED）显微镜对比传统的萋尼氏染色镜检（Ziehl-Neelsen acid-fast staining，ZN）具有更高的敏感性，而且能进一步定性，具有操作和成本优势。在2009年，WHO推荐LED显微镜镜检替代Z-N镜检[3]。金胺O-罗丹明染色（Auramine O-Rhodamine fluorescent staining，AO or AR）是使用荧光显微镜观察抗酸杆菌（包括分枝杆菌）的组织学技术。这种技术被认为是优于萋-尼氏抗酸染色的方法[4, 5]。

二、基于细菌培养的检测方法

培养方法是MTB检测的金标准，罗氏培养法、BD BACTEC™分枝杆菌生长指示管法是最常用的MTB检测方法。前者检测周期耗时较长，大约需要4周左右，且检测灵敏度较低；后者是一种非放射性、基于荧光的手动或自动化系统，可用于从各种临床标本中快速检测分枝杆菌，该配备的培养基、营养添加剂、杂菌抑制剂价格高昂，不利于基层开展[5]。

基于药敏试验的培养方法是目前准确检测二线药物耐药情况的唯一可用方法。但是需要数周才能获得结果，且对实验室的装备和人员有较高要求，还需要一个有效的运输系统，以确保痰标本的活性。尽管现在已有快速的商业化的液体培养系统可供使用，但由于花费及基础设施方面的要求，在很多结核病高负担国家建立具有足够结核分枝杆菌培养能力的实验室，进程进展缓慢。

多年来，一些非商业化的更为快速和廉价的培养以及药物敏感性试验（DST）方法被开发出来，其中包括显微观察药物敏感性检测技术（microscopic observation drug susceptibility，MODS）、薄层琼脂法（Thin-layer agar，TLA）、硝酸还原酶法（nitrate reductase assay, NRA）和比色氧化还原指示剂（colorimetric redox-indicator，CRI）等[6]。

三、免疫学检测方法

相对于SSM，MTB特定生物标记物的检测技术可能给MTB感染提供了一个更低成本和更快速有效的筛选工具。

1. 结核菌素皮试试验（Tuberculin Skin Test, TST）应用结核菌素对机体进行测定，观察人体能否被引发皮肤迟发超敏反应，以此来判断人体对于结核分枝杆菌有无免疫力，进而判断受试者是否曾经感染过结核分枝杆菌。然而，对于已经接种卡介苗（BCG）的人而言，TST试验会显示一种假阳性结果；对于免疫功能不全的人则会显示一种假阴性的结果[5, 7]。

2. γ- 干扰素释放试验（interferon-γ release assay，IGRA）是指通过检测患者全血或分离自全血的单核细胞在 MTB 特异性抗原刺激下产生的γ-干扰素，判断受试者是否感染MTB的检测方法[5]。但在实际使用中发现，IGRA在不同地区、不同人群中的特异度和敏感度均存在较大差异。此外，不同IGRA产品使用的抗原、检测试剂、检测参数和界值设定等可能存在差异，对最终检测结果及其判读有一定影响，且无法区分活动性结核病与潜伏性结核感染[5, 8]。

3. 脂阿拉伯甘露糖（LAM）检测可以提高HIV感染后期患者对TB可疑性的鉴定。2013年，Alere Determine™ TB LAM Ag 横向流动试纸检测成为第一个用于HIV合并感染结核病患者床边尿检的商用诊断方法，该方法只需要60 µl的尿液即可在25分钟之内提供结果[5]。目前，尿液LAM检测的准确性研究成为主要研究方向。该方法检测的患者群体具有多样性，包括肺外结核病患者、无法主动提供痰液的肺结核患者及住院患者等。因此，LAM检测相较于痰涂片镜检以及结核分枝杆菌及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（Xpert MTB/RIF）的递增价值不断改变[9]。

4. 挥发性有机化合物（Volatile organic chemicals，VOCs）以及结核分枝杆菌其他特异的分子标记物可在5分钟内自动排除结核感染。最近，作为潜在结核病诊断目标的一些挥发性有机化合物，通过训练过的袋鼠对人体痰标本的气味检测进行了验证。这些挥发性有机化合物来自结核分枝杆菌的代谢以及人体组织损伤。分析仪器灵敏度的提高促进了该方法的进步[10]。

此外，结核病血液检测可以衡量患者免疫系统对结核分枝杆菌抵抗的强弱。酶联免疫吸附试验 （ELISA）、免疫斑点技术（DIGFA）、免疫胶体金技术、蛋白芯片技术等亦为针对结核分枝杆菌抗原抗体进行检测的免疫学诊断方法。

四、分子检测方法

用核酸扩增试验（NAAT）对结核进行分子诊断，快速且具有高度特异性，并能预测结核分枝杆菌的耐药性。

1. 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP技术在恒温条件下对目标基因进行扩增，具有特异性高、效率高、速度快的特点，是传统的NAAT的替代。与超快速提取试剂盒（PURE-TB-LAMP）来协同提取痰液标本结核分枝杆菌的DNA，并消除抑制性物质，加强了对原痰液标本中结核分枝杆菌快速检测的灵敏性和特异性，并提高了生物安全的措施[11]。

2016年8月11日，WHO在日内瓦发布了一份最新的推荐书，推荐TB-LAMP法（环介导等温扩增，loop-mediated isothermal amplification）为发展中国家的基础医疗单位，例如社区医院等地方使用的新的结核病检测方法。这种方法经过评估，可以作为痰涂片检测方法的替代方案。该检测方式对实验室基础设施、设备的要求较少[12]。然而， TB-LAMP对于涂片阴性的样本的检测灵敏性有局限性，对于交叉污染、假阳性结果、TB-LAMP结果的用户依赖性以及需要全面的培训和质量保证存在可能的风险性[13]。且TB-LAMP法无法检测出患者的耐药性，因此这种检测方法仅适用于非多耐药结核患者（MDR-TB）。

2. 结核分枝杆菌及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（Xpert MTB/RIF）

Xpert MTB/RIF作为一个完全自动化的集成NAAT平台，包括样品制备、扩增和DNA检测，是目前对于结核分枝杆菌最先进的工具。Xpert MTB/RIF可以针对很多现有的商业化的NAAT方法所具有的局限性进行处理，例如交叉污染、时间消耗以及实验室问题等。Xpert MTB/RIF检测是在一个封闭的系统中进行扩增，在2小时内可同时确认结核分枝杆菌的存在以及利福平抗性突变[14]。与所有的NAAT试验类似，Xpert MTB/RIF检测方法的敏感性不如培养方法，但是比涂片镜检敏感，提高了结核病患者的细菌学确诊比例。

3. 结核分枝杆菌线性探针耐药检测技术（LPA）

除了Xpert MTB/RIF，LPA是WHO认可的从痰涂片阳性标本或者结核分枝杆菌菌株中快速诊断TB和MDR-TB的分子试验[15]。GenoType MTBDRplus LPA是市售可获得的用于检测对一线药物如利福平和异烟肼抗性的方法，以及它的下一代GenoType MTBDRsl，可以检测对二线药物例如氟喹诺酮类、氨基糖甙类、环肽、乙胺丁醇和链霉素的抗性。

线性探针可以通过DNA杂交技术在2天内从临床标本中检测赋予临床样品抗生素耐药性的基因突变。目前，LPA不止可用来快速检测涂片阳性的标本，同时可用来检测抗酸杆菌（AFB）涂片阴性而PCR结果阳性的耐药结核杆菌（DR-TB）[16]。尽管线性探针目前已经被很多国家所采用，作为传统DST的替代，专家组建议，GenoType MTBDRsl LPA不能用于广泛耐药结核病的检测，因为尽管其对二线药物抗性检测具有高特异性，但是灵敏度较低[15, 17]。此外，LPA一般非常昂贵，需要复杂的实验室基础设施，因此其在低收入、高负担的国家的作用和实用价值将需要实地进行评估。

4. 基因芯片耐多药检测方法

该方法是一种可以快速检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的分子生物学方法[18]。与传统的细菌学药敏实验相比，完成整个检测仅需要6 h，方便快速。人类尿液中含有一些濒死的体细胞或者微生物中大约300碱基对的细胞自由片段称为Transrenal DNA。这些片段是传染病诊断目标，因为至少在理论上，可以无需侵入受感染的身体组织而将它们扩增。然而在几个比较小的实践研究中，检测尿液中的结核分枝杆菌衍生的Transrenal DNA的灵敏度相差很大[19]。

结核病的诊断是结核病防治的关键，现有或新出现的技术在分析前诊断肺结核可以通过优化样本采集或通过更好地保存样品的完整性提供渐进式改进。这些方法可以与现有的一些技术（SSM, NAAT或培养）协同以提供更好的诊断结果。同样，自动显微镜系统可以通过改善工作量、效率或资源需求（熟练的工作人员和质量保证）等方式迎接挑战，提高诊断率。基于NAAT的检测方法的途径是传染源诊断技术的核心，在不同水平的实验室中都具有不断发展的空间与前景。线性探针的范围很大，一些具体的方法可以提供特异的结核诊断以及药物敏感性测试。芯片技术可通过降低测试的复杂性提供更大等位基因变异的筛选。这些技术目前面临的挑战是对于其用途性能充分的证据。然而，许多技术还缺乏足够的验证，以提供其对于提高结核诊断的真正的性能以及潜力。检测样本、检测因子等单一化，程序复杂，成本高昂，不适用于大规模推广普及。因此，今后的工作尚需寻找新的检测靶标，发展新的诊断方法，研发新的诊断试剂。

作者简介

李国保，主任医师、教授；南方科技大学第二附属医院肺病医学部副主任、肺病三科主任。

长期在临床一线工作，从事呼吸、结核病、危重症临床救治工作。在危重结核病、气管镜及机械通气的临床应用、耐药肺结核并呼吸衰竭救治、结核性毁损肺的肺保护性机械通气、危重患者评估、院内获得性感染等临床和研究方面，取得了一定的成绩。在呼吸系统危重疾病及突发公共卫生事件救治方面有较为丰富的临床经验。其在2007年创立的呼吸、危重症学科为深圳市突发公共卫生事件如H1N1、H7N9及本单位呼吸危重疾病救治做出了应有的贡献并积累了较为丰富的临床经验。荣获省级科技成果奖3项，市级科技成果奖4项，市科技进步奖3项。近年来完成了“十一五”国家重大专项2项，“十二五”国家重大专项1项， “十三五”国家重大专项1项。深圳市科研立项1项。

社会任职：中华医学会结核病学分会委员、重症专业委员会主任委员；中国医药教育协会感染疾病专业委员会委员；广东省医学会结核病学分会副主任委员；广东省药学会呼吸用药委员会委员，深圳市医学会结核病专委会主任委员、呼吸专业委员会常务委员；深圳市医师协会结核病专委会主任委员。深圳市突发公共卫生事件医疗救治专家组专家。

马爱静，女，医学博士，出生年月1990.03，从事结核分枝杆菌与常见非结核分枝杆菌快速诊断及药物敏感性研究。

参考文献

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[2] G. J. Churchyard, W. S. Stevens, L. D. Mametja, K. M. McCarthy, V. Chihota, M. P. Nicol, et al., "Xpert MTB/RIF versus sputum microscopy as the initial diagnostic test for tuberculosis: a cluster-randomised trial embedded in South African roll-out of Xpert MTB/RIF," Lancet Glob Health, vol. 3, pp. e450-7, Aug 2015.

[3] W. H. Organization. (2015). Global tuberculosis report 2015.

[4] A. Jain, A. Bhargava, and S. K. Agarwal, "A comparative study of two commonly used staining techniques for acid fast bacilli in clinical specimens," Indian Journal of Tuberculosis, vol. 49, pp. 161-162, 2002.

[5] 马爱静 and 赵雁林, "结核病实验室诊断研究进展," 中华临床实验室管理电子杂志, pp. 33-38.

[6] in Noncommercial Culture and Drug-Susceptibility Testing Methods for Screening Patients at Risk for Multidrug-Resistant Tuberculosis: Policy Statement, ed Geneva, 2011.

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[15] W. H. Organization. (2013). The use of molecular line probe assay for the detection of resistance to second-line anti-tuberculosis drugs: Expert group meeting report. .

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[19] A. Cannas, D. Goletti, E. Girardi, T. Chiacchio, L. Calvo, G. Cuzzi, et al., "Mycobacterium tuberculosis DNA detection in soluble fraction of urine from pulmonary tuberculosis patients," Int J Tuberc Lung Dis, vol. 12, pp. 146-51, Feb 2008.

北航联合华西医院研发结核低成本快速筛查生物芯片

2020年疫情之初，迅速暴增的感染人数给病原体核酸检测带来巨大的挑战，北京航空航天大学微纳生物芯片专家、常凌乾及团队，与四川大学华西医院一起承担了新冠病毒核酸检测紧急专项，研发出能在25分钟之内快速核酸检测的便携式设备。

如今，双方再次携手，这次他们要帮助的对象，是我国中西部地区贫困山区，例如，四川大凉山贫困地区的结核病人。这些地方，结核杆菌引起的呼吸道疾病依然比较严重，且成为一种致命性流行病。结核病，是由结核分枝杆菌引起的传染病，也是致死率最高的单传染病原体之一。据世界卫生组织统计，2019年结核病导致1000多万新感染病例，140万人死亡。因此，快速准确诊断疑似结核病携带者的方法，仍然是抑制其传播的关键。要想判断是否患有这种疾病，就得进行结核杆菌检测，这时就需要大型核酸检测设备。但这种仪器价格昂贵，对实验室和专业人员的要求都比较高，一般都局限在三甲医院检验科，很难应用在偏远地区。

这些因素都阻碍了结核病在偏远地区的快速筛查诊断。因此，迫切需要设计低成本、易于操作且准确的平台来弥合这一差距。

经过一年多的研发和验证，常凌乾及团队制造出一种低成本、便携式的微流控装置，并给其命名为Fd-MC（finger-driven disposable micro-platform ）。这种既不需要电，也不需要额外设备，此外还得价格便宜、测试快速，总之一切都要以简单为主。

这种装置同时具备低成本、便携、手指驱动等特点，并搭载重组酶聚合酶核酸等温扩增技术，集核酸提取、扩 增、检测于一体，可对痰液样本中的结核杆菌实现便携现场快速检测。只需动动手指，就能在一个完全分离的微通道中，完成完整的结核病诊断过程。

日前，相关论文已由合作双方发在Biosensors ＆Bioelectrnics（IF: 10.6）上，论文题为 《基于等温扩增的手指驱动一次性微平台在结核病多点诊断中的应用》（A finger-driven disposable micro-platform based on isothermal amplification for the application of multiplexed and point-of-care diagnosis of tuberculosis） 。第一作者是北航博士生王之莹，共同通讯作者分别是北航常凌乾教授、以及华西医院检验科主任应斌武教授。

图 | 相关论文（来源：受访者）

可摆脱对电力、外部泵的依赖

Fd-MC大约有手掌那么大，长度55mm、宽度66mm、厚度5mm，上面有一个直径1.6mm的样品注入孔，还有两个用于存储相应缓冲液的圆柱形腔，以及用于DNA提取的微通道。

芯片基底采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）进行激光刻蚀，并在缓冲液储存室的上表面覆盖弹性膜。当按压弹性膜时，可直接驱动液体在微流道中流动，从而可摆脱对电力、外部泵的依赖。

此外，在芯片上设计了“W”形通道的DNA提取区，并在内部填充二氧化硅颗粒，基于二氧化硅对病原体的核酸进行固相萃取。当样品进入到微通道与硅粒子混合时，在高浓度的盐离子作用下，样品中带负电荷的DNA分子通过阳离子盐桥与硅粒子结合，从而被吸附于二氧化硅珠上。

研究中，常凌乾团队采用基于FAM探针的原位荧光策略，通过手持式紫外灯，可用肉眼读取芯片的结果。因此在避免感染或环境污染的风险方面，Fd-MC具有独特的优势。

在检测区，常凌乾团队设计了5个平行的“y形”反应区“y形”反应区由“y形”通道和圆柱形腔室组成，每个“y形”腔室由一个小的通道连接。一旦液体进入检测区域，将首先填满“y形”通道，直到装置被轻微摇晃才会流入到装载有RPA反应物的圆柱形腔室。这种设计可以建立一个物理分区，允许每个室形成一个独立的环境，避免液体流动造成的交叉污染。

该团队在多重检测中，针对人型结核分枝杆菌(MTB)、 结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群(MTBC)、分枝杆菌(MB)，分别设计 RPA 特异性引物。该芯片不仅能识别结核/非结核感染，还能区分人结核分枝杆菌/牛结核分枝杆菌。

图 | Fd-MC（来源：受访者）

在操作时，把经过前处理的痰液或者咽拭子加到进样口，依次用手指按压两个弹性膜。然后，将芯片置于 37-42℃的温度，20 分钟之内即可实现核酸等温扩增。测试完之后，将芯片置于设计的小型读取设备中，并用手机App进行拍照，通过荧光显色，表明受测者是否患有结核，甚至还能检测结核的亚型。

总的来说，Fd-MC能够实现芯片上的“样本输入和结果输出”，集成了包括从结核病病原体中提取DNA、基于RPA（重组酶聚合酶扩增）的荧光可视化的多个操作步骤。

图 | 基于核酸等温扩增的手指驱动式微流控芯片（Fd-MC）快速检测结核杆菌的原理示意图（来源：受访者）

37个样本，全部检查正确

Fd-MC通过37个临床样本进行了验证，包括奇美拉分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，以及由中国四川大学华西医院提供的20份临床阳性痰样本，和健康志愿者们捐赠的10份健康痰样本。所有临床样本均经华西医院经伦理批准确认。

验证结果表明，与商业实时荧光RPA相比，在对37个临床样本的检测中，Fd-MC获得了100%的特异性（指正确检测阴性样本的能力)，敏感度(指正确检测阳性样本的能力）为95.2%。

图 | Fd-MC 对临床结核病样本诊断的验证（来源：受访者）

与其他需要外部驱动泵或离心的微流控装置不同，Fd-MC通过手指按压驱动液体流动的方式，对样本进行DNA固相提取和RPA扩增，操作简单快捷，消除了对技术人员的需要。

Fd-MC的一个显著卖点是其较低的成本。以GeneXpert为例，这种大型仪器的成本为17500美元，年度维护费为1800美元，大大限制了在偏远地区的应用。相比之下，Fd-MC所需材料包括微流控芯片、RPA缓冲液、酶和引物在内的所有元素，总成本小于8美元。而且，Fd-MC的检测速度快，包括DNA提取和RPA扩增的总时间控制在30min内（qPCR通常是2小时），这有利于结核病的快速筛查。

在未来，常凌乾团队也考虑将Fd-MC和数字RPA的结合可以准确地定量DNA浓度。通过将RPA试剂分配到带有微孔阵列的芯片中，经过RPA反应后，检测发出荧光的孔（阳性孔）。对于低浓度的DNA模板，阳性孔的数量低于高浓度的DNA模板。因此，可以通过计数阳性孔的数量进行定量分析，从而识别低浓度的病原体。

总的来说，该团队设计了一款手指驱动式的微流控芯片，该通用的POC平台有望在资源有限的环境中，进行快速、现场、大规模的传染性病原体筛查。

该技术已启动转化落地

2020年初，疫情的突然造访，导致大量样本等待筛查。为此四川省启动了紧急重点专项，并由四川大学生物治疗国家重点实验室教授耿佳，和华西医院实验医学科主任应斌武一起牵头，联合北航常凌乾团队，开始了新冠病毒核酸检测的紧急事业，并随着合作研究的深入，逐渐延伸到其他种类的病原体检测。

双方此前也在技术转化方面进行了长期合作。论文和专利公开以后，该技术已开始寻求技术转化。

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