基于miRNA-mRNA调控网络股骨头坏死的关键基因筛选与分析

摘要：

文题释义：

miRNA的调控特点： 成熟的miRNA 通过碱基互补配对方式识别靶基因mRNA，发挥降解作用或直接阻断翻译过程。目前已经有>2 000 个miRNA 被证实可在人体表达并参与调控30%的基因。

miRNA的作用特点： 大量研究表明miRNA几乎参与疾病发生进展的全过程，包括增殖、凋亡、血管生成以及分化等，在不同类型疾病中通过作用于特定的靶基因mRNA，发挥抑制或促进疾病发生发展的作用。

背景： microRNA (miRNA)被证实参与了股骨头坏死的发生、发展及防治，但其作用机制尚不清楚。

目的： 借助GEO数据库，采用生物信息学手段探讨股骨头坏死相关的miRNA-mRNA调控关系对，阐释其潜在的作用机制。

方法： 通过GEO数据库下载股骨头坏死相关的miRNA芯片数据集(GSE89587)和mRNA芯片数据集(GSE74089)，借助R软件Limma包进行数据差异表达分析，使用miRDB、miRTarbase和TargetScan数据库预测差异表达miRNA调控的潜在下游靶基因，利用Cytoscape构建miRNA-mRNA调控网络，通过R软件clusterProfiler包对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，借助STRING数据库构建调控网络中靶基因的蛋白互作网络。

结果与结论： ①实验共筛选出23个差异表达的miRNA，其中10个上调(如hsa-miR-4325，hsa-miR-3654)，13个下调(如hsa-miR-4680-5p，hsa-miR-4711-3p)；②实验共筛选出3 992个差异表达mRNA，其中2 503个上调(如TGFBI，AMTN)，1 489个下调(如MSMP、FLJ35424)；③利用Targetscan、miRTarBase和miRDB数据库预测出255个同时存在于3个数据库的下游靶基因，整理出10个miRNA(如hsa-miR-3920、hsa-miR-3675-5p)和34个mRNA(如MAPK6、SP1)进行调控网络构建；④GO和KEGG富集分析主要集中在调节mRNA稳定性、转化生长因子β信号通路及自噬等；⑤DDX3X、HNRNPC和SP1作为PPI网络中的枢纽基因，可能是股骨头坏死的关键靶标；⑥实验构建的miRNA-mRNA调控网络在一定程度上阐明了miR-4725-3p可能靶向抑制SP1介导的转化生长因子β信号通路诱发股骨头坏死发病，为股骨头坏死的防治诊疗提供了强有力的数据支撑和研究方向。

https://orcid.org/0000-0001-5649-4212(梁学振)；https://orcid.org/0000-0002-4587-6650 (李刚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 股骨头坏死, GEO数据库, 差异基因, 调控网络, miRNA-mRNA, 基因, 蛋白, 生物信息学

引用本文: 梁学振, 谢国鑫, 李嘉程, 温明韬, 许波, 李刚. 基于miRNA-mRNA调控网络股骨头坏死的关键基因筛选与分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1720-1727.

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基于miRNA-mRNA调控网络股骨头坏死的关键基因筛选与分析

微型芯片可实现细胞“变种”，皮肤细胞有望成为人体损伤的救命稻

一直以来，人体中形形色色的细胞都被视作构成生命的基础，但细胞的多样性也意味着一旦某一部分的组织或器官出现损伤的话，其它健康完好的细胞很难作为“救火队员”，立马进行修补。

为了解决这个问题，俄亥俄州立大学再生医学和细胞治疗中心的 Chandan Sen 博士和 L. James Lee 博士所领导的研究团队开发了一种只有指甲大小的便携式芯片，它可以在不到一秒的时间之内对皮肤细胞完成转染，并将之转换成人体内任何其他类型的细胞。 而这一技术也被发表在 8 月 7 日的《Nature Nanotechnology》上。

图丨皮肤转染芯片

这种被称为非侵入性组织纳米转染（The noninvasive tissue nanotransfection，TNT）的技术已经在老鼠和猪身上做过了相关的实验。在使用 TNT 技术后，这些动物的皮肤细胞能够被诱导形成完整的血管，并且和现有的脉管系统进行连接，进而治疗坏死的皮瓣、挽救严重缺血的伤腿等。

在后续实验中，研究人员甚至将小鼠的表皮细胞转化成为了功能健全的神经元。在几周时间内，这些神经元就可以从动物的皮肤表面被移植入动物脑中，从而逆转因为中风而留下的后遗症。

图丨神经元细胞

总的来说，TNT 可以被归类为一种微型电穿孔技术，最早是由 Lee 团队于 6 年前研发的。 它由两个主要的部分组成，一是引诱可塑性的负荷，该负荷可能是质粒、DNA 或者 RNA。利用 RNA，可以把基因整合的风险降到最低。二是纳米电穿孔芯片，该芯片是利用微纳米合成技术制备得到的。

而微型电穿孔技术的特点就是能将新细胞的重编程基因直接通过细胞外膜上开启的的临时通道注入表皮细胞中。在这一过程中首先将搭载有重要重编程因子的芯片放置于皮肤表面，然后，电流会间歇性地通过芯片，从而在细胞外膜中打开微型通道，基因也正是从这些通道中被注入表皮细胞的。

俄亥俄州立大学化学与生物分子专业的 Lee 教授说，“由于纳米孔的电阻非常大，电流实际上是很小的。因此，这一手段是安全的，对转染的细胞或组织所造成的损伤几乎可以忽略不计。”

图丨 Chandan Sen 博士手持芯片

不仅如此，Chandan Sen 博士还强调，TNT 技术在实践过程中不需要大型的实验室器材或精密的操作技巧，可以在医护场所甚至生活场景中直接进行实施。整个过程仅需要不到一秒，只需要把芯片贴附于皮肤表面就可以了。

“你只需要一枚芯片、细胞转变所需的重编程因子和一个电源。” 他说。若是组织和器官病变或受伤，我们可以通过 TNT 技术将皮肤细胞转变为所需要的任何种类细胞。此时此刻，患者的皮肤就像是一片土壤肥沃的“农场”，只要栽种下皮肤细胞，就可以“收获”各类型的人体组织细胞。一个例子就是，利用 TNT 技术可以在 3-4 周的时间内就将皮肤细胞转换成可以植入大脑的神经元，而研究者们目前已经成功在小鼠皮肤表面培育了成千上万的神经元。

Sen 博士又补充说，使用电穿孔技术输送非病毒性基因并不是什么新鲜事，但是传统电穿孔技术所需要的复杂操作则大大限制了它的成功率 ，“复杂的电穿孔操作使整个细胞膜都能够被渗透，并会影响细胞骨架，从而降低细胞的可塑性。

图丨电穿孔技术操作示意

与此相反的是，TNT 技术在细胞膜内产生一系列微型通道，并且仅影响细胞表面 2% 的区域，不会抑制细胞的可塑性。在 TNT 技术的使用过程中，我们已经实现了超过 98% 的转染效率与细胞转化的成功率。”

在研究人员发表在《Nature Nanotechnology》的论文中，他们详细地描述了在小鼠体内进行的两组实验。在实验中，他们将皮肤细胞重编程，并将其转化为血管细胞。第一组小鼠的血管细胞用于防止小鼠的全层皮瓣坏死；第二组小鼠的血管细胞则是用于抢救因被移除了股动脉而缺血的四肢。

在未经处理的对照组中，小鼠的腿由于缺乏血液流动而迅速坏死，而使用 TNT 技术治疗的小鼠后腿则在几周之内长出了能够正常工作的血管。三周过后，这些小鼠并没有接受除了 TNT 之外的其它治疗，但是它们已经长出了功能健全的血管，受伤的四肢也几乎痊愈。

图丨使用TNT 技术的修复对照实验

Sen 博士表示，他们利用有序的纳米阵列，将目标因子输送到身体中，实现组织重新编程，而不仅仅是细胞的重新编程。通过重编程皮肤细胞可以产生血管，在不需要其他任何补充的情况下，就可以修复四肢。他表示，“我们不仅仅制造血管原性细胞，而是制造上百个功能血管，这才是最大的区别所在。”

他认为这项技术的潜在应用是巨大的。利用皮肤细胞，除了可以产生血管和功能性神经元，研究人员还把老鼠皮肤细胞转化成产生胰岛素的细胞，用以针对动物血液中的葡萄糖含量水平来分泌胰岛素。

Lee 博士也表示，基于皮肤的转染或者重新编程技术有很多潜在的应用，比如 DNA 疫苗、糖尿病人的神经元再生以及某些情况下的头发再生。此外，TNT 技术还可应用于其他组织。他们成功证实了 TNT 技术用于肌肉组织和脂肪组织（重新编程白脂肪细胞转化为褐色脂肪细胞）。除了皮肤组织，TNT 技术还适用于外表组织（比如眼睛、耳朵等）以及外科手术中裸露的组织（比如骨骼修复、器官诊断等）。

不过，在转染技术的蔓延性问题上，Sen 博士还是做出了特别的强调。虽然转染技术本质上是局限于皮肤最外层的表皮细胞，但是实际上转染效应还会蔓延到真皮细胞。他们在论文中也提到，“研究结果表明 TNT 技术不仅仅应用于重新编程因子的局部传送，而且适用于重新编程刺激物蔓延（从表皮到真皮）的协同反应。”

“对于转染技术能够蔓延到更深层的皮肤组织细胞，我们感到非常惊奇。目前，我们的研究结果表明转染的表皮细胞能够释放功能性生物分子（包括 mRNA 和蛋白质），这使得转染效应传递到组织中的其他细胞。”Lee 博士说。但该过程发生的详细机理有待于进一步研究。

不过，即便转染效应会蔓延到真皮细胞之中，也无需对此过多担心。因为相较于现有的实现活体组织转染的物理方法，比如电穿孔和基因枪，TNT 技术更加温和，造成的组织损伤最小。

当然，他们对于 TNT 技术应用的探索也并未停止。Lee 博士早期的研究就曾证明使用以 TNT 为代表的纳米电穿孔技术输送其它核酸货物的潜力，这是正在进行的一个重要的研究领域。他说，“在我们的体外细胞转染研究中，我们已经证明 2D 和 3D NEP 生物芯片还可以将微小 RNA（miRNA）和小干扰 RNA（siRNA）载体递送到癌细胞，通过影响致癌基因来杀死细胞。除此以外，我们也在参照 CRISPR / Cas9 基因编辑技术来应用 TNT 技术。”

Sen 博士指出，在争取 FDA 批准的情况下，初步的 TNT 临床试验可在一年内开始，用于严重的肢体缺血应用。 一个小型的美国国立卫生研究院（NIH）资助项目目前就在支持神经病学领域的早期工作，该团队还与沃尔特里德陆军医疗中心（Walter Reed Army Medical Center）合作，进行 TNT 技术拯救受伤的四肢和周围神经损伤的潜在应用。