抗体芯片技术是什么？在肾病患者的尿液细胞因子检测中有何作用？

各种慢性肾脏病进行性发展的共同结局是终末期肾病（ESRD）。ESRD正在成为威胁人类健康的杀手。

虽然肾脏替代治疗在过去的半个世纪获得了长足的进步，但是在发展中国家有大量患者无法接受这种昂贵的替代治疗。

即使接受肾脏替代疗法，各种治疗并发症仍可能使患者最终因治疗失败而失去生命。来自美国的统计资料显示，每年ESRD患者的病死率高达21％－23％。

流行病学研究表明ESRD已不再是少见病而是严重威胁人类健康的常见病。根据美国肾脏数据统计系统（USRDS）的数据显示， 从1988年到2002年，美国的ESRD的发病率从38.4/百万人口上升到98.3/百万人口。

据估计未来十年该数据仍将以每年4.1％的百分比上升。进入ESRD的患者为延续生命必须接受透析移植等肾脏替代治疗。

统计显示全球因ESRD进入透析的人数由1990年的42.6万增长至2000年的106.5万，预计2010年将达到200余万人。

这一人数的增长，造成由于透析的医疗费用的迅速增长： 由80年代的2000亿至90年代约4500亿，预计至2010年将达到万余亿。

在我国虽然尚缺乏完整的流行病学研究数据，但是1999年全国透析移植报告的数据显示当年新进入透析的患者占透析总人数的41.7％，间接提示了我国ESRD发病的上升趋势。

根据美国第三次健康与营养调查（NHANESⅢ）结果显示,在各阶段慢性肾脏病中，ESRD仅仅占了0.6％。

可见ESRD只是冰山的一角，其背后还隐藏着冰山的底座——早期慢性肾脏病（CKD）患者。 目前国际上对于CKD公认的定义为：

肾脏损害≥3个月，表现为下列之一者：肾脏病理异常和/或尿成分异常（如有血尿、电解质异常、pH异常） 和/或影像学异常；或GFR<60ml/min/1.73m2，有或无肾脏损害。

K/DOQI指南中根据肾脏受损程度，将CKD分为5期，即CKD1期：肾小球滤过率（GFR）正常或增高， 但有证据表明肾脏已有受损（如有微量白蛋白尿/蛋白尿、血尿或者以前有过肾脏病史）；

CKD2期：GFR略有下降（60－89ml/min/1.73m2）；CKD3期：GFR中度下降（30－59ml/min/1.73m2）；CKD4期：肾衰竭期， GFR重度下降（15－29ml/min/1.73m2）；

CKD5期：GFR<15ml/min/1.73m2，为延续生命必须进行透析或移植等肾脏替代治疗。根据MDRD研究，K/DOQI分期中GFR下降的转折点（30ml/min、60ml/min）与CKD并发症的发生有密切的关系。

当GFR下降至60ml/min时高血压、贫血、血清铁蛋白降低、iPTH升高、肾性骨病、低钙高磷等并发症的发生明显增多，当GFR进一步下降至30ml/min时，上述并发症的发生率直线上升。

令人振奋的是，大量研究结果已证明如果在CKD的早期干预治疗高血压、高血脂、贫血、钙磷代谢异常与骨病等将会延缓肾功能恶化，减少心血管并发症， 降低CKD患者总体的死亡率。

同时也节省了医疗费用和卫生资源。因此，近年来国际肾脏病学界关注的重点已由ESRD前移至CKD。对于CKD的早期诊断、监测和防治已成为全球性的公共卫生事件。

然而如何实现CKD的早期诊断和动态监测一直是肾脏病学界面临的难题。 目前，尿蛋白（包括微量白蛋白）和血肌酐（用以评估肾功能）的检测是临床筛查CKD患者的重要手段。

然而，这些指标更多地反映的是机体病理生理过程中的一些共性特征,缺乏组织结构与功能变化之间的内在联系,更无法展现疾病特定条件下的一些特征性改变。

因此，寻找一种全新的技术平台以满足CKD的早期诊断、动态监测需要已成为我们共同面对的巨大挑战。要解决好这个问题需要对疾病发展过程有一个系统的认识。

人们已经知道各种原因引起的CKD进行性发展的实质是肾脏纤维化，近年来临床和实验研究均证实，肾脏纤维化是由多种细胞因子所介导的复杂的病理生理过程。

我们及其他学者近年的研究提示，肾脏在各种损害性因素作用下， 肾脏局部产生的致炎因子和致纤维化因子在CKD发生发展过程中发挥着关键性作用。

这些细胞因子在体内形成了一个复杂的网络，通过交互对话（crosstalk）等相互影响，进而活化肾脏固有细胞，影响胞外基质的产生和降解，最终导致胞外基质成份的过度堆积和肾脏固有结构的消失以及肾功能的下降。

过去十几年对于这些致炎、致纤维化细胞因子作用研究的主要目的是探讨CKD发生发展机制，以期为临床干预CKD的进程提供新的靶点。

然而，有趣的是近年来一些证据提示这些细胞因子有希望成为CKD早期诊断、动态监测以及判断药物治疗效果 的“生物学标记物”（biomarkers）。

众所周知，肾脏的主要功能之一是对血液的超滤作用形成原尿,经肾小管重吸收后形成终尿排出体外。尿液中蕴含着丰富的生物学信息。

正常尿液中可含有少量的蛋白成分, 如白蛋白、糖蛋白、β2微球蛋白以及种类众多的细胞因子等。

研究表明，尿液中这些致炎致纤维化细胞因子的有无、量的多少以及量的变化都可能和肾脏疾病发生、发展、转归等有着密切联系。

既往的研究发现，尿中MCP-1、TGF-β可能是反映肾脏病变活动和进展的一项敏感指标， 其他作者也先后证实，肾脏病患者尿液中的CTGF、MMP-9、TIMP-1、IL-2、IL-6、TNF-α变化与肾脏疾病的活动性和严重程度显著相关。

既往的这些研究均是检测尿液中单一细胞因子的水平，这种方法存在以下不足之处:首先，检测成本较高，检测效率较低；

其次，由于在肾脏疾病进展过程中常常不是单一细胞因子的变化,而是多种细胞因子的的协同作用，显然，对于单一细胞因子的研究无助于我们从整体上把握这些因子之间的相互联系；

另外，单一因子作为生物学标记物早期诊断、动态监测肾脏病，其敏感性、特异性均不能令人满意。

基于以上认识，我们设想如果能够在一次研究中高通量、平行性的检测测尿液中多种细胞因子的变化，将有助于我们更清楚地认识肾脏纤维化发生发展过程中各细胞因子的作用，有助于早期发现并动态监测肾脏纤维化进程。

此对于肾脏纤维化的防治具有十分重要的临床意义。 然而，这在既往的技术条件下是一项不可完成的任务。

“蛋白质组学”(proteomics) 的产生和发展为揭示肾脏纤维化的发生机制、研究肾脏疾病生物标志物创造了崭新的技术平台。

蛋白质组学这个词来源于蛋白质组（proteome）,蛋白质组与同类术语基因组（genome）相一致， 由澳大利亚悉尼MarcWilkins于1994年在意大利Siena的一次2-DE国际会议上首次提出,是指基因组所表达的全部的蛋白质。

更为详尽的表述是细胞、组织或机体在特定时间和空间上基因组所表达的蛋白质。由于同一时间内特定的细胞组织或有机体中并非所有的蛋白都表达，因此蛋白质组是动态的。

蛋白质组学是一门以蛋白质组为研究对象，以全面的蛋白质的性质为研究基础，在蛋白质水平上定量、动态、整体地研究生物体， 并由此在更深层次上对疾病机理、细胞模式、及功能联系等方面进行探索的科学。

1996年提出了“尿蛋白质组学”(urinaryproteomics)的概念, 即:利用蛋白质组学技术高通量、系统性地分析和鉴定尿液中的所有蛋白质分子并研究其生物学功能。

这对尿生物标志物的鉴定及其在肾脏疾病的诊断、病程的监测和药物靶点的开发 具有重要的实际意义。

蛋白质组学的研究流程大体可分为蛋白质分离、鉴定以及信息资料分析处理三大步骤。即先从组织、细胞或体液中提取蛋白质, 进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE)或液相色谱(LC)以实现蛋白质的分离;

然后采用高灵敏度的染色方法进行显色,再结合专门的图像处理软件，对蛋白质斑点进行定量分析， 寻找不同样品间差异表达的蛋白质；

分离后的蛋白经不同的质谱(MS) ——基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI－TOF－MS)和电喷雾电离质谱(ESI－MS)等获得肽质量指纹图(PMF)、肽序列标签(PST)或部分氨基酸序列。

最后,应用适当的软件以及生物信息学的相关技术，搜寻基因组和蛋白质组数据库,实现对这些差异表达蛋白质进行定性鉴定。

实践证明上述蛋白组学技术作为一种高通量的技术平台，为生命科学的研究提供了高效率的研究工具。

但是同时也存在许多缺点：①低丰度蛋白的鉴定。在2－DE分离复杂蛋白样品时低丰度蛋白通常会被高丰度蛋白所掩盖。

而我们所要研究的细胞因子在尿液中的含量通常很低甚至达到pg级，这显然限制了此技术平台的应用。

②极碱蛋白（pI>8.5）难以分离。目前应用2－DE能够分离的蛋白质的pH值范围通常为3.5－8.5，而pI>8.5的蛋白质难以分离。

③极大(>200kD)或极小(<10kD)蛋白的分离。④难溶蛋白的检测,这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白；这些膜蛋白通常包括受体以及通道蛋白等，他们对于细胞发挥生物学功能起着十分重要的作用。

目前寻找有效、快捷的蛋白分析技术已成为蛋白组学研究中至关重要的环节。蛋白质芯片（Proteinchip）是为满足蛋白组学研究的需要而发展起来的生物芯片技术。

其原理是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。

由于抗原抗体反应具有高度的特异性，用单克隆抗体固定在载体表面充当捕获探针所构建的蛋白质芯片称为抗体芯片，又称为抗体微阵列（antibodymicroarray）。

目前，抗体芯片根据是否需要对待检测样品中的目标分子进行标记，分为两类：①目标蛋白标记法：

采用双色荧光显示系统以Cy5标记样品中的蛋白质，而用固定浓度的Cy3标记物作为内置参照，通过测试其荧光灰度比值，即可反应样品中目标蛋白的水平。

但是由于样品中的目标蛋白本来就很微量，再进行复杂标记后可能会丧失活性。②夹心免疫测定法（sandwitchimmunoassay）：

这种方法是在双抗体夹心的ELISA方法基础上发展起来的，是ELISA技术同微阵列技术的有机结合。

这种检测体系包括一对抗体，其中一种抗体固定于载体表面作为捕获抗体， 另一种抗体需要应用荧光、酶、生物素等进行标记，充当检测抗体，他们组成一个抗体对，识别同一抗原的不同表位。

抗体蛋白芯片检测利用了免疫测定的基本原理即抗原抗体之间作用的高度的特异性,由于抗原抗体间“分子识别”作用的存在使得蛋白质的分离和鉴定在一步同时完成。

因此抗体芯片具有以下优点： ①能够快速、准确、高通量的分析大量的蛋白质，并且可以研究蛋白质间的相互作用。

②操作简单，效率高，仅需将少量样本滴加于芯片上就可进行分析与检测。③由于单克隆抗体与抗原的免疫反应具有高度的特异性，这种“分子识别”使得抗体蛋白芯片的检测结果可靠，分辨率高，这是其他蛋白组学技术所不具备的。

④基于微阵列（microarray）技术构建， 拥有比其他免疫测定技术(如ELISA)更高的灵敏度。抗体蛋白芯片一经问世就受到了众多学者和商业机构的关注。

第一张商品化的抗体芯片是由美国BDClontech公司推出的。这种芯片上排列了378种已知蛋白的单抗，检测过程需要对样品中目标分子进行荧光标记。

最近，美国Raybiotech公司也成功开发出了包含138细胞因子的抗体芯片，与BDClontech公司产品不同， 这是一种基于夹心免疫检测技术的抗体芯片可以直接完成对血液、尿液、细胞裂解液中细胞因子的检测。

一些专用芯片如癌症诊断蛋白质芯片，肝炎诊断蛋白质芯片，SARS诊断蛋白质芯片也相继投放市场。

它的成功开发并日益完善，将为疾病相关分子的发现、疾病的分子诊断和新药开发提供崭新的研究手段,并具有广阔的市场前景。

抗体芯片作为一项全新的技术平台尚处于起步阶段，虽然已有一些相关产品问世，但是由于许多技术环节上并没有获得突破，所以其应用范围受到了一定限制。

尽管如此，随着技术的进步和不断完善，抗体蛋白芯片技术正在逐步得到研究者的认可，并且在越来越多的生物医学研究领域得到应用。

抗体芯片（antibody microarrays）

【蛋白芯片概述】

蛋白质芯片是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列。蛋白芯片技术的基本原理: 将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上，然后，用标记了特定荧光的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。固定在芯片上的蛋白可以是：抗原、抗体、小肽、受体和配体、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA复合物等。

蛋白芯片的分类：《蛋白功能芯片》 ：天然蛋白点加在基片上，了解体系中哪种蛋白能与已知的某种蛋白结合，用于天然蛋白活性及分子亲和性研究。《蛋白检测芯片》 ：将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用于识别复杂生物样品中的目标蛋白/多肽。

蛋白质芯片的优点 ：(1)蛋白芯片上可以实现成千上万个蛋白质样品的高通量平行分析,一次实验可提供大量数据-----高通量；(2)有高的信噪比，高准确性、高灵敏度; (3)所需样品量极少----微量化; (4)在整个基因组和蛋白质组水平将DNA序列信息与蛋白质产物直接联系起来；(5)快速、微型化和自动化。

【蛋白芯片的制作系统】

蛋白芯片平台 包括：芯片制造、处理、表面化学、检测试剂、扫描和分析，该系统适用于多种蛋白检测，包括：多样品微量免疫测定、蛋白质-抗体、抗体-蛋白质、抗体-抗原、蛋白质-蛋白质和蛋白质-药物的检测。生物芯片技术的核心是生物芯片的制备及反应信号的检测。蛋白质芯片的制作原理有多种,片基可采用尼龙膜、聚丙烯酰胺凝胶、玻片、硅片和金片等。

图1 蛋白质芯片的制作系统

图2 蛋白质芯片的制作系统主体

图3 48针的机械手进行点样 （48针机械手可以在6小时内对50个具有1,000点样点的芯片进行点样）

图4 针状点样的枪头

图5 操作控制面板

图6 洗涤以及干燥台

图7 信号检测系统

【抗体芯片的概述】

抗体芯片的称谓来源于免疫学角度,由于其在微生物感染检测中巨大的潜在应用价值而引起人们广泛的兴趣,是蛋白质芯片研究中进展速度较快的一个分支。抗体芯片：生物样品蛋白表达的抗体芯片完整系统的作用是用于比较两个生物样品，检测两者蛋白表达得相对差别。抗体芯片由数百个按一定顺序共价结合在载玻片上的单克隆抗体组成。由细胞单克隆产生的单一构型的蛋白，这些抗体能够大量产生，而且对可以在细胞表面发现的特定目的抗原具有特异的亲和力，这些抗原往往是恶性的。、

抗体芯片的优点 ：1.可以通过同时比较数百种蛋白，使特定蛋白与我们感兴趣的生理和病理过程发生关系。2.使用单克隆抗体准确性高，敏感度高，专一性强。3.单克隆抗体的使用时芯片制作只需知道其DNA序列。4.通用性。

抗体芯片的应用 ：不同蛋白表达的测定；毒性检测；疾病研究，诊断筛选； 癌症研究；药物开发等。

图 8 AbMicroarray 380(Cat.No.K1847-1)----Clontech公司第一个商业化抗体芯片

整个分析过程可以在一天内完成，用荧光分析的方法比较两个样品之间378个蛋白质的相对丰度；适用于包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品；试剂盒提供完整的样品抽提制备、标记、孵育所需的Buffer，特别设计的样品制备的过程能保持样品的完整性和溶解性，保证制备样品具有代表性和一致性。芯片上的抗体包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，跨度大、适用范围广。芯片上的抗体分别经过特异性抗原、细胞系和组织的检测，灵敏度高达pg/ml。开放性的芯片平台设计，可以用各种型号DNA芯片荧光扫描仪进行检测。

【抗体芯片的操作原理】

图 9 抗体芯片的操作原理示意图

整个操作流程包括：1.从50—200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提；2.用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品；3.洗去多余的标记分子；4.与芯片杂交孵育；5.扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成，操作者只要准备好样品、荧光染料、脱盐纯化柱（处理体液样品时用）和荧光扫描仪，其他的试剂全部由试剂盒提供。

整个抗体芯片的操作流程需要注意的重要的两点分别是：1.抗原—抗体结合效率差异；2.不同荧光分子的标记效率差异（Cy5标记的样品信号偏高） ————内源标准化处理。内源标准化处理是指对两个样品（A、B）中分别用两种荧光标记分子（Cy3和Cy5）标记，并交叉与芯片杂交（A-Cy5和B-Cy3一组,A-Cy3和B-Cy5一组分别和芯片杂交）。

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